全转录组(具体信息见“全转录组测序业务”)

l  CircRNA测序（以下都是针对CircRNA-seq）


 

l  total RNA大于等于20ug 
l  OD260/280为1.8-2.2 
l  适用范围：有参考基因组

l  HiSeq4000或者XTEN, PE150 
l  测序量建议10G以上

l  circRNA分析：

上图中展示的为常规分析的内容，部分内容需要在报告出具且与老师沟通后执行；
部分高级分析内容请点击“生物信息分析”；
定制分析请与业务人员沟通，安排合适的分析人员进行交流。
l  ceRNA分析：

l  部分结果展示：

箱线图

相关性分析

PCA分析

样本间聚类

样本相关性热图

火山图

Gene ontology分类图

LncRNA功能和调控机制预测

ceRNA调控网络

1.       研究circRNA，选择全转录组测序还是circRNA测序？
这个问题是我们经常遇到的一个问题。其实各有优劣：
全转录组测序是一种性价比非常高的方案：1、花一份钱，同时得到三种RNA(mRNA，lncRNA，circRNA)的信息；2、同一个体系中出来，系统误差最小；3、在分析时，方便进行三种lncRNA联合分析。劣势在于，如果仅就circRNA研究而言，该种方法没有去除线性RNA，就会带来这样的后果：1、达不到富集circRNA的效果。综合现有文献报道，没有富集的话，较通过去线性RNA的专门的circRNA-seq，检测到的circRNA仅为circRNA-seq 10%-60%不等；2、由于线性RNA的干扰，鉴定到的circRNA假阳性高；3、线性RNA还会影响circRNA定量和差异分析。
CirRNA测序的优点就是去除了线性RNA，对circRNA达到富集效果，且circRNA定量更加准确。缺点就是只能检测到circRNA(其实这也不能算是缺点)。
总而言之，对于需要专门研究circRNA的老师，特别是要建立某些物种circRNA数据库的老师，我们强烈建议采用circRNA测序，而对于想要整体研究RNA，circRNA只是研究中的一部分的老师，全转录组也不失为一个好选择。其实，两种方式还可以综合起来使用，想要探讨的老师可以写邮件至service@orizymes。
2.       circcRNA测序需要多大的测序量？
circRNA测序量建议至少10G以上，如果经费允许，建议测到20G以上。鉴定circRNA主要是识别backsplice的junction区域，如果测序量过低，支持这样区域的reads过少，不准确。那么测到多少会达到饱和呢？我们做过circRNA测序的测序量梯度分析，从5G-30G，每5G一个梯度，到30G时检测到的circRNA数量还有较大的增加，说明就该实验而言，至少30G还无法达到饱和。对于转录本的鉴定，SEQC做过实验，数据量增加到200G还有新的转录本鉴定到。所以，以我们目前的测序量是远远没有达到饱和的。
3.       是否需要生物学重复？重复几次？
生物学重复的设置是实验设计中一个不可或缺的部分。设置生物学重复的目的主要包括如下两个：1通过重复样品的平均值得到更准确的测量结果；2计算样品群体的方差，从统计学方法上判断两组样品质检的差异是否具有显著性。在设计实验时如果没有生物学重复或者生物学重复数量不够，就不能得到有统计意义的实验结果，获得的差异表达基因很可能仅仅是少数个体差异的表现，而不能反映群体的本质特征。所以实验中设计合理数量的生物学重复是非常重要的。
早期基于高通量测序的组学研究，可以不设置生物学重复，或通过将若干生物学重复混合为一个样本后测序的策略，来部分弥补个体差异的影响（如 BMC genomics等SCI期刊上的相关研究普遍采取这个策略）。随着测序价格不断下降，对多个生物重复样本的单独进行测序也逐渐成为高通量测序项目的趋势。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性，与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复，高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。
4.       每组样本应该设置几组生物学重复？
实际应用中，对于重复数目的选取主要考虑以下两个方面：1取样误差；2基因差异的大小。在各种生物学材料中，样本间误差值由低至高依次为培养细胞、动植物组织、人体正常细胞，最后是人体肿瘤组织(往往需要取到6-8重复及以上)。对于样本间误差大、基因差异小的情况应适当增加重复样品的数量。
对于您设计的这个实验，您认为样本间的误差是比较小的，可以适当减少重复的数量。建议您最好能够设置至少3个生物学重复，原因如下：

1. 统计学上一般是认为3个及以上生物学重复计算出来的统计学差异才有意义，如果您仅设计2个生物学重复，在后续发文章时，很可能会因为生物学重复设置不够被编辑质疑；
2. 开始没有设生物学重复或者设两个生物学重复，后续分析或者写文章的过程中发现需要补生物学重复，这种情况下，由于不是一批实验，不同批次实验材料之间误差和系统误差都会变大，结果肯定是没有同一批次做出来的结果准确和漂亮。
3. 很多分析必须在设3个及以上生物学重复的时候才能进行。您以后可能会利用这一批数据进行深层挖掘，比如共表达分析，miRNA-mRNA关联，甲基化-mRNA关联，lncRNA靶基因预测、各种组学联合等等分析，那么这些分析很多都是基于至少三重复的基础上进行的。

更多信息可以与我公司业务人员联系或者写邮件至service@orizymes.com咨询。