iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是由美国应用生物系统公司ABI 研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,尔后进行串联质谱分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。
1. 具有多种标记试剂,可同时对8个样品进行蛋白差异分析。 2. 该技术为体外标记,可标记各种动物组织、植物组织、微生物、血浆、体液、细胞培养物、等样本。 3. 和以凝胶为基础的定量方法比较,该技术不仅可发现胞浆蛋白,还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白,并可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。 4. 报告离子的相对分子质量较低(113-121),低分子量区是质谱定性(质量确定)和定量(丰度比较)较为准确的区域,因此质谱检测更为灵敏可靠。 5. 自动化程度高:液相与质谱连用,自动化操作,分析速度快。
itraq试剂由三部分组成:报告基团、质量平衡基团和肽反应标记试剂基团,形成4种或8种相对分子质量均为145的等量异位标签。 iTRAQ试剂标记酶解后的肽段,可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质谱中,报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂,质量平衡基团丢失,带不同同位素标签的同一多肽产生质量为114,115,116和117Da的报告离子,根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。
整个实验分为预实验和正式实验部分,总实验周期为6周。 预实验部分包括:蛋白样品制备,蛋白定量,SDS-PAGE胶,蛋白酶解,质谱预实验,出具预实验报告。以确保蛋白和肽段样品符合正式实验的要求。 正式实验部分包括:ITRAQ标签标记,SCX色谱分级,正式实验质谱分析,数据库检索及出具正式实验报告。
实验原理,实验流程,实验试剂仪器,实验步骤及参数,实验结果 分析数据:全部检测蛋白的登录号及名称,分子量、等电点、肽段数等常规数据,蛋白定量数据及相应的p值。 生物信息学分析数据:统计学差异表达蛋白的GO,pathway,network分析报告 RAW文件:质谱原始数据文件
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