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Small RNA（包括miRNAs、siRNAs和piRNAs等）是生命活动中重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢紊乱发挥着重要的作用。通过高通量测序手段进行smallRNA检测和定量，不受物种限制，具有高灵敏度和高精确性，既能鉴定特定条件下表达的miRNA，也能发现新的miRNA，同时还可用生物信息学分析筛选进行定量和差异表达分析。

动物的miRNA和植物的miRNA有什么不同？分析策略上是否不同？

首先动物和植物的miRNA的区别如下表格：

动植物miRNA的区别
茎环结构	植物的更大、更复杂，预测的折回（fold-back）长度变异（64-303nt）比动物miRNA（60-70nt）明显。
miRNA长度	植物多为21nt，而动物miRNA长度多为22-23nt，这源于Drosha与DCL1切割性能的差异。
保守性	保守性均较高，但是植物相对于动物保守性更高。
miRNA末端碱基	植物miRNA 5’端优选尿嘧啶U，热力学分析表明：这种末端不稳态是通过RISC来维持的。
miRNA前体加工	植物miRNA前提由Dicer酶执行两步切割，在细胞核内形成互补双链，出核解旋后发挥功能：而动物miRNA的前提在核内由Drosha仅完成初步切割，产物以茎环结构形式转移到细胞质中，由Dicer酶完成第二步切割，形成互补双链形式。
靶基因的配对方式	植物miRNA与靶mRNA几乎完全互补配对，而大多数动物miRNA与其靶mRNA不是互补完全配对的。
靶基因结合位点	植物miRNA可以与靶mRNA的任何区域结合（主要是蛋白编码区），通过切割靶mRNA或抑制靶mRNA翻译实现对基因表达的调控，动物miRNA主要针对靶mRNA的3’非编码区域（3’UTR），作用机制为抑制翻译。

由于如上所述的差异，导致了分析策略不一样。
2. 是否需要生物学重复？重复几次？
生物学重复的设置是实验设计中一个不可或缺的部分。设置生物学重复的目的主要包括如下两个：1通过重复样品的平均值得到更准确的测量结果；2计算样品群体的方差，从统计学方法上判断两组样品质检的差异是否具有显著性。在设计实验时如果没有生物学重复或者生物学重复数量不够，就不能得到有统计意义的实验结果，获得的差异表达基因很可能仅仅是少数个体差异的表现，而不能反映群体的本质特征。所以实验中设计合理数量的生物学重复是非常重要的。
早期基于高通量测序的组学研究（如RNA-seq），可以不设置生物学重复，或通过将若干生物学重复混合为一个样本后测序的策略，来部分弥补个体差异的影响（如 BMC genomics等SCI期刊上的相关研究普遍采取这个策略）。随着测序价格不断下降，对多个生物重复样本的单独进行测序也逐渐成为高通量测序项目的趋势。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性，与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复，高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。
3. 每组样本应该设置几组生物学重复？
实际应用中，对于重复数目的选取主要考虑以下两个方面：1取样误差；2基因差异的大小。在各种生物学材料中，样本间误差值由低至高依次为培养细胞、动植物组织、人体正常细胞，最后是人体肿瘤组织(往往需要取到6-8重复及以上)。对于样本间误差大、基因差异小的情况应适当增加重复样品的数量。
对于您设计的这个实验，您认为样本间的误差是比较小的，可以适当减少重复的数量。建议您最好能够设置至少3个生物学重复，原因如下：

统计学上一般是认为3个及以上生物学重复计算出来的统计学差异才有意义，如果您仅设计2个生物学重复，在后续发文章时，很可能会因为生物学重复设置不够被编辑质疑；
开始没有设生物学重复或者设两个生物学重复，后续分析或者写文章的过程中发现需要补生物学重复，这种情况下，由于不是一批实验，不同批次实验材料之间误差和系统误差都会变大，结果肯定是没有同一批次做出来的结果准确和漂亮。
很多分析必须在设3个及以上生物学重复的时候才能进行。您以后可能会利用这一批数据进行深层挖掘，比如共表达分析，miRNA-mRNA关联，甲基化-miRNA关联，lncRNA靶基因预测、各种组学联合等等分析，那么这些分析很多都是基于至少三重复的基础上进行的。

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